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蛋白純化及經驗總結
發布時間:2018-11-20 15:51:30| 瀏覽次數:

    蛋白純化及經驗總結

     

     

    一、分離純化蛋白質的一般程序
     分離純化蛋白質的一般程序可分為以下幾個步驟:
    (一)材料的預處理及細胞破碎
        分離提純某一種蛋白質時,首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態,不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有:


     
    (二)蛋白質粗制品的獲得
         選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法:
        
    (三)樣品的進一步分離純化
         用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質,須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有:凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。


    二、蛋白純化過程中的注意事項

    1、操作盡可能置于冰上或者在冷庫內進行。

    2、不要太稀,蛋白濃度維持在μg/mL~mg/mL。

    3、合適的pH,除非是進行聚焦層析,所使用的緩沖溶液pH避免與pI相同,防止蛋白質的沉淀。

    4、使用蛋白酶抑制劑,防止蛋白酶對目標蛋白的降解;在純化細胞中的蛋白質時,加入DNA酶,降解DNA,防止DNA對蛋白的污染。

    5、避免樣品反復凍融和劇烈攪動,以防蛋白質的變性。

    6、緩沖溶液成分盡量模擬細胞內環境。

    7、在緩沖溶液中加入0.1~1mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)(或β-巰基乙醇),防止蛋白質的氧化。

    8、加1~10mmol/LEDTA金屬螯合劑,防止重金屬對目標蛋白的破壞。

    9、使用滅菌溶液,防止微生物生長。


        


 
 
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