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Western-Blot 常見問題與經驗(一)
發布時間:2018-11-24 11:14:48| 瀏覽次數:

    1. 為什么目標蛋白被轉移到膜上的量少?

    原因:凝膠太厚、蛋白分子量< 10KDSDS濃度不合適、蛋白的等電點< 9等等。

    經驗:延長轉膜時間、在陰極buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高轉膜效率、

    更換高pHBuffer、蛋白分子量<10KD時,減少轉膜時間、使用小孔徑的膜。

     

    2. 為什么背景過高?

    原因:抗體濃度過高、膜沒有均勻浸濕、封閉不充分、抗體與封閉劑出現交叉反應、膜或者緩沖液受到污染。

    經驗:雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度、轉膜前用100%甲醇將膜完全浸濕

    檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應、拿取膜與吸水紙時要戴手套,更換新鮮轉膜緩沖液。

     

    3. 為什么出現非特異條帶?

    原因:一抗不是唯一特異的、二抗出現非特異結合。

    經驗:制備單克隆抗體或者重新選取合成抗原多肽的位點、設立不加一抗,只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非特異結合。

     

    4. 為什么雜交信號很弱?

    原因:抗體保存不當、抗原不充足、膜的漂洗過度。

    經驗:減少漂洗的時間和次數、抗體長期保存應在-70℃,使用前做效價檢測、

    增加蛋白上樣量,做已知標準量蛋白的對照。

     

    5. 目的帶很弱,怎么加強?

    經驗:加大抗原上樣量、將一抗稀釋比例降低。

     

    6. 為什么目標帶是空白,周圍有背景?

    原因:一抗濃度過高、二抗HRP 催化活力過強、顯色底物處于一個臨界點、反應時間不長,將周圍底物催化完,形成了空白即“反亮現象”。

    經驗:將一抗和二抗濃度降低,或更換新底物。


 
 
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