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細胞全蛋白的提取及樣本處理、濃度測定
發布時間:2019-03-30 11:31:09| 瀏覽次數:
TAG: 全蛋白的提取 蛋白濃度測定 蛋白樣本處理

    關鍵詞:全蛋白的提取;蛋白濃度測定;蛋白樣本處理

    具體步驟如下:

    1)處于對數生長期的各組細胞,4℃預冷的1×PBS洗滌2-3次,棄去上清液。

    2)用細胞刮刮下貼壁細胞,收集細胞懸液至離心管,4℃1000rpm;離心5min,移走上清液。

    3)加入細胞裂解混合溶液(裂解液:PMSF為100:1),充分吹打,混勻細胞(每100ml培養瓶加100ul含1mMPMSF的細胞全蛋白裂解液),冰浴30min, 使細胞充分裂解。

    5)4℃,15000rpm,離心10min,吸取上清液(即蛋白)。

    蛋白樣品處理

    1) 按4:1比例在蛋白樣品中加入5×蛋白上樣緩沖液,100℃煮沸5-10min,充分變性冷卻至室溫,-80℃保存以備后續實驗使用。

    2) 留取5-10μl蛋白樣品,用BCA法測定蛋白濃度。

    蛋白濃度測定

    蛋白濃度的測定使用BCA蛋白濃度測定試劑盒,按照說明書進行

    1) 配制BCA工作液:A液:B液為50:1,混勻備用。

    2)稀釋標準品:取濃度為5mg/ml的標準品10μl,加PBS稀釋至100μl,終濃度0.5mg/ml。

    3)按下表加標準品至96孔板標準空中,每孔總體積為20μl。

    4)每孔加入待測樣品5μl,加入PBS至20μl。

    5)每孔加BCA工作液200μl,37℃孵育30min,冷卻至室溫。

    6)OD值測定:酶標儀波長570nm,各孔吸光度。

    7)根據標準品OD值得出標準曲線,進而計算每孔樣品濃度。 


 
 
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