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WesternBlot 檢測ART、AKT、P-AKT、mTOR 蛋白表達
發布時間:2019-03-30 11:31:41| 瀏覽次數:
TAG: WesternBlot AKT mTOR

    關鍵詞:WesternBlot;AKT;mTOR

    1) 配制SDS變性凝膠:根據目標蛋白不同分子量,選取適合分離膠濃度。

    2)上樣:蛋白樣品30ug,并加入預染maker,避免產生氣泡。

    3)電泳:冰浴,恒壓法,直至目的蛋白跑開。

    4)切膠:根據maker位置,切取目標蛋白所在相應位置凝膠,以備轉膜。

    5)切膜去電極:相應凝膠大小的PVDF膜,置于100%甲醇,去電極以備轉膜使用。

    6)電轉:冰浴,恒流,濕轉,根據目標蛋白分子量的不同,轉膜時間稍有差別,一般來講,分子量越大,轉膜所需時間越長。

    7)封閉:PVDF膜,TBST緩沖液洗膜后(3次,5min/次),5%脫脂牛奶封閉液或5%BSA封閉液,室溫封閉2小時。

    8)一抗孵育:TBST洗膜(搖床,3次,5min/次),加入按比例稀釋好的一抗,密封,4℃密封過夜。

    9)二抗孵育:TBST洗膜(搖床,3次,5min/次),加入按比例稀釋好的二抗,室溫孵育2小時。

    10)洗膜:TBST洗膜(搖床,3次,10min/次)

    11)顯色:按ECL試劑盒說明書進行,Bio-Rad凝膠成像系統采集圖像。

    12)圖像分析:Quantity one 軟件進行。

    (13) 抗體稀釋比例:ART1 1:500,AKT 1:1000,P-AKT 1:500,mTOR 1:1000, β-actin 1:1000

    目的蛋白表達相對含量%=目的蛋白條帶積分光密度/內參條帶積分光密度*100%  

     


 
 
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