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腎臟冰凍切片免疫熒光
發布時間:2019-04-22 11:33:42| 瀏覽次數:
TAG: 腎臟 冰凍切片 免疫熒光

    關鍵詞:腎臟;冰凍切片;免疫熒光

     

    組織冰凍切片、4%多聚甲醛、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二酸鉀、燒杯、量筒、磁力攪拌器、10M NaOH溶液、吐溫-20、triton x-100,正常驢血清、ddH2O、組化筆、移液器、一抗、熒光素標記的二抗、DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚)、熒光防淬滅劑、洗盒、無色指甲油、蓋玻片、正置熒光顯微鏡

    7.2 主要試劑配制

    10XPBS(磷酸鹽緩沖液)母液:稱取80g氯化鈉、2g氯化鉀、35.8g磷酸氫二鈉、2g磷酸二氫鉀于1000ml燒杯中,加入800ml ddH2O,磁力攪拌器混勻至溶質完全溶解,使用將10M NaOH溶液將pH值調到7.4,再用ddH2O定容至1000ml,轉移到藍色廣口瓶中室溫長期保存。

    0.5‰ PBST溶液:將10XPBS(PH7.4)稀釋10倍至1XPBS,加0.5ml吐溫-20,混勻即可使用。

    1‰ triton x-100破膜液:10ml triton x-100加到10ml ddH2O中。

    5%驢血清封閉液:50ml正常驢血清,9950ml ddH2O。

    7.3 腎臟冰凍切片免疫熒光實驗步驟

    1)對于O.C.T.包埋的腎臟冰凍組織,用冰凍切片機切成5mm厚的冰凍切片,長期保存在-80℃冰箱;

    2)將冰凍切片取出,室溫干燥10min(沒有水汽);

    3)用組化筆沿組織周圍化圈,后組織上滴加4%多聚甲醛固定10min;

    4)0.5‰ PBST洗5min*3;

    5) 1‰ triton x-100 溶液破膜15min (唯獨Ki67需要步驟5和6,其余直接到步驟7);

    6)0.5‰PBST洗5min*3;

    7)5%驢血清封閉液室溫封閉1h;

    8)一抗按合適比例用1XPBS(兩個抗體則需如1:500 LYVE-1,1:50 Ki67混合孵育)稀釋后,滴加在組織上,1XPBS作陰性對照,4℃避光孵育過夜(16h-19h);

    9)第二天切片從冰箱取出恢復至室溫(約30min);

    10)0.5‰PBST洗5min*3;

    11)熒光素標記的熒光二抗用1XPBS稀釋500倍(兩個二抗則需如Alexa 488 驢抗兔熒光/二抗Cy3驢抗山羊熒光二抗混合孵育),二抗37℃或者室溫孵育1h;

    12)0.5‰PBST洗5min*3;

    13)DAPI染核5min;

    14)0.5‰PBST洗5min*3;

    15)滴加適量熒光防淬滅劑,用蓋玻片封片,蓋玻片周圍用無色指甲油加固防止滑動損傷組織;

    16)正置熒光顯微鏡拍照。

    注:4%多聚甲醛固定后防止干片;二抗孵育開始注意避光;混合孵育時兩個一抗須為不同種屬來源,二抗則選擇不同顏色熒光素標記的。 


 
 
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