關鍵詞:Western blot;蛋白;樣品;制備

     

     

    物品準備: 10mg/ml標準蛋白、1xPBS、BCA試劑盒、96孔板、微量移液器、37℃恒溫培養箱、酶標儀、RIPA(強)裂解液、5x上樣緩沖液、水浴鍋、電磁爐、

    8.2.2 蛋白樣品的濃度測定及制備

    1)蛋白標準品的制備:取出50ml濃度為10mg/ml的蛋白質標準品,每次各吸取25ml 1XPBS倍比稀釋蛋白標準品如下

    2)蛋白樣品濃度的測定

    1)每個待測蛋白樣品取5ml稀釋5倍至25ml;

    2)BCA工作液:A:B=50:1 ;

    3)將蛋白標準品和待測蛋白樣品加到96孔板中(5ml/孔,設復孔);

    4)每個孔加95ml BCA工作液,放入37℃恒溫培養箱孵育30min;

    5) 酶標儀測分光光度值(562nm波長);

    6)根據蛋白標準品標準曲線算出待測蛋白樣品的終濃度;

    7)用RIPA裂解液和5x上樣緩沖液將蛋白樣品最終濃度稀釋到2mg/ml;

    8)上述稀釋好的蛋白樣品放置沸水中5-10min,之后直接后續步驟后者分裝-80℃保存。